Barnaba urodził się na Cyprze w żydowskiej rodzinie z pokolenia Lewiego. Jego właściwe imię brzmiało Józef, ale Apostołowie dali mu przydomek Barnaba. Według Klemensa Aleksandryjskiego i Euzebiusza Barnaba miał należeć do grona 72 uczniów Pana Jezusa. Był krewnym św. Marka Ewangelisty, dlatego św. Paweł nazywa go kuzynem Ewangelisty (Kol 4, 10). Barnaba zapewne razem ze św. Pawłem przybył do Jerozolimy, aby u stóp Gamaliela, znanego rabina - uczonego żydowskiego, pogłębić swoją wiedzę w zakresie religii mojżeszowej. Dzieje Apostolskie tymi słowy wprowadzają nas w okoliczności początków jego działalności. "Józef, nazwany przez Apostołów Barnabas, to znaczy Syn Pocieszenia, lewita rodem z Cypru, sprzedał ziemię, którą posiadał, a pieniądze przyniósł i złożył u stóp Apostołów" (Dz 4, 36-37).
O powadze, jakiej zażywał wśród Apostołów, świadczy to, że to Barnaba przygarnął św. Pawła po jego nawróceniu i dopiero z Barnabą Paweł mógł pójść do pozostałych Apostołów (Dz 9, 26-27). Wraz ze św. Pawłem Barnaba udał się do Antiochii, gdzie pozyskali wielką liczbę wiernych dla Chrystusa. Był to rok 42 po narodzeniu Pana Jezusa. Barnaba i Paweł swoje nauczanie kierowali najpierw do Żydów. Kiedy jednak ci ich odrzucili, poszli do pogan. Aby jednak neofitów nie zrazić, nie nakładano na nich żadnych obowiązków prawa mojżeszowego, a żądano jedynie, by dawali świadectwo Chrystusowi przez przyjęcie chrztu i życie zgodne z Ewangelią. Wieść o tym dotarła jednak do gminy jerozolimskiej, która pilnie przestrzegała prawa mojżeszowego. Barnaba po raz pierwszy wprowadził Pawła do gminy żydowskiej. Obaj Apostołowie bronili tam swojego kierunku działania wobec nawróconych z pogaństwa. Ich stanowczymi przeciwnikami byli natomiast nawróceni Żydzi. Sprawę rozstrzygnął na korzyść Barnaby i Pawła św. Piotr, a poparł go św. Jakub Młodszy. Ustalono, że wolno nawracać pogan, kiedy w danym mieście Żydzi nie przyjmą nauki Chrystusa Pana, oraz że nawróconym z pogaństwa nie należy narzucać obowiązku zachowania prawa mojżeszowego (Dz 15, 1-35).

Barnaba był człowiekiem dobrym, pełnym Ducha Świętego i wiary (Dz 11, 22-24). Razem ze św. Markiem jako towarzysz św. Pawła udał się w pierwszą podróż misyjną na Cypr, a stamtąd do Azji Mniejszej (Dz 13, 1-14). Na Cyprze dokonali nawrócenia namiestnika wyspy, Sergiusza Pawła. Kiedy w miasteczku Perge św. Paweł uzdrowił człowieka chromego, "na widok tego, co uczynił Paweł, tłumy zaczęły wołać po likaońsku: «Bogowie przybrali postać ludzi i zstąpili do nas». Barnabę nazwali Zeusem, a Pawła Hermesem, gdyż głównie on przemawiał. A kapłan Zeusa, który miał świątynię przed miastem, przywiódł przed bramy woły i przyniósł wieńce, i chciał z tłumem złożyć (im) ofiarę. Na wieść o tym Apostołowie Barnaba i Paweł rozdarli szaty (...) Zawiedziony tłum od entuzjazmu przeszedł do wściekłości". Pobudzeni przez Żydów z Ikonium poganie omal nie pozbawili Apostołów życia, św. Pawła ukamienowali, ale cudem wyszedł z ich rąk (Dz 14, 1-21).
Barnaba zamierzał wraz z Pawłem udać się w drugą podróż misyjną. Doszło jednak do konfliktu, gdyż Paweł stanowczo sprzeciwił się, by w tej podróży brał udział również Marek, który w czasie pierwszej wyprawy samowolnie ich opuścił. Barnaba w tej sytuacji wycofał się i powrócił z Markiem na Cypr, gdzie kontynuowali pracę apostolską (Dz 15, 39-40). Odtąd giną wszelkie informacje o Barnabie. Według podania miał pozostać na Cyprze jako pierwszy biskup i pasterz tej wyspy. Miał także działać w Rzymie, Aleksandrii, Mediolanie. Około 60 r. na Cyprze, w mieście Salaminie, poniósł wedle tego przekazu śmierć męczeńską przez ukamienowanie. Jak mówi podanie, za cesarza Zenona w roku 488 odnaleziono relikwie św. Barnaby. Miał on na piersiach Ewangelię św. Mateusza, którą sam własnoręcznie dla swojego użytku przepisał.
Jak wielką popularnością cieszył się w pierwotnym chrześcijaństwie św. Barnaba, świadczą liczne apokryfy: Dzieje Barnaby, Ewangelia Barnaby oraz List Barnaby. Dzieje Barnaby opisują walki, jakie Apostoł musiał staczać z Żydami, którzy mieli go spalić żywcem. Jego prochy miał zebrać ze czcią św. Marek. Dziełko powstało ok. roku 400 na Cyprze. Ewangelię Barnaby mieli napisać gnostycy. Jest wspomniana w pismach niektórych ojców apostolskich, ale jej treści bliżej nie znamy. Ciekawym dokumentem jest List Barnaby z wieku II, w którym autor poleca alegorycznie tłumaczyć teksty Pisma świętego. Teologicznie cenną jest druga część tego Listu, mówiąca o preegzystencji Chrystusa Pana, o tajemnicy Jego wcielenia i o dwóch drogach - światła i ciemności.
Kult św. Barnaby był już w czasach apostolskich tak wielki, że tylko jemu jednemu z uczniów Dzieje Apostolskie nadają zaszczytny tytuł Apostoła. W wieku XVI powstał zakon Regularnych Kleryków św. Pawła, założony przez św. Antoniego Marię Zaccaria, od macierzystego kościoła św. Barnaby nazywany popularnie barnabitami.
Barnaba jest patronem Florencji i Mediolanu, w którym według tradycji nauczał; czczony jest także jako orędownik podczas kłótni, sporów, smutku oraz burz gradowych.

W ikonografii św. Barnaba przedstawiany jest jako starszy mężczyzna z długą brodą w tunice i płaszczu albo w szatach biskupich, czasami jako kardynał. Jego atrybutami są: ewangeliarz, zwój pergaminu, gałązka oliwna, halabarda, model kościoła.